高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography\HPLC)又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。

高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。

作為分析化學(xué)中被廣泛使用的一種技術(shù)，高效液相色譜法用于分離、鑒定和量化混合物中的成分。高效液相色譜分離的成功與否在很大程度上取決于流動(dòng)相的特性，流動(dòng)相是流經(jīng)固定相的液體溶劑。應(yīng)根據(jù)分析物的化學(xué)性質(zhì)和所用固定相的性質(zhì)仔細(xì)選擇流動(dòng)相。該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)應(yīng)用。

什么是流動(dòng)相？

流動(dòng)相是流經(jīng)高效液相色譜柱固定相的液體溶劑，攜帶著分析物。其兩個(gè)主要作用如下：

? 溶解樣品成分并將其帶入固定相；

? 與固定相相互作用，促進(jìn)分析物的分離。

流動(dòng)相的類型

高效液相色譜法使用的流動(dòng)相可分為兩大類：

? 水性流動(dòng)相(主要成分是水)

高效液相色譜分離通常使用水性流動(dòng)相，因?yàn)樗粤鲃?dòng)相能有效溶解多種分析物，而且價(jià)格通常低于非水性溶劑。常見的水性流動(dòng)相是水與甲醇或乙腈等有機(jī)試劑的混合物。有機(jī)改性劑的選擇取決于所分離分析物的性質(zhì)和所使用的固定相。

? 非水性流動(dòng)相(不含水)

當(dāng)被分離的分析物不溶于水或水會(huì)干擾分離時(shí)，就會(huì)使用非水性流動(dòng)相。非水性流動(dòng)相包括二氯甲烷、四氫呋喃和正己烷等溶劑。這些溶劑通常與甲醇或乙腈等極性溶劑結(jié)合使用，以提高分離效率。

流動(dòng)相的特性

流動(dòng)相的特性對(duì)高效液相色譜分離至關(guān)重要，因?yàn)樗鼈儠?huì)大大影響分離效率和選擇性。其重要特性包括極性、粘度、pH值和離子強(qiáng)度。

? 極性

流動(dòng)相的極性是高效液相色譜分離的關(guān)鍵因素，因?yàn)樗鼪Q定了分析物與固定相之間相互作用的強(qiáng)度。極性流動(dòng)相適用于分離極性化合物，而非極性流動(dòng)相則是分離非極性化合物的理想選擇。可通過(guò)改變水性流動(dòng)相中有機(jī)改性劑與水的比例來(lái)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性。

? 粘度

粘度是流動(dòng)相的另一個(gè)關(guān)鍵屬性，因?yàn)樗鼤?huì)影響流動(dòng)相通過(guò)色譜柱所需的流速和壓力。流動(dòng)相的粘度可通過(guò)改變?nèi)軇┏煞帧囟然驂毫?lái)調(diào)節(jié)。

? pH

流動(dòng)相的pH值在高效液相色譜分離中非常重要，因?yàn)樗鼤?huì)影響分析物和固定相的電離狀態(tài)。流動(dòng)相的pH值應(yīng)根據(jù)被分離分析物和所用固定相的pKa值進(jìn)行調(diào)節(jié)。如堿性流動(dòng)相適合分離酸性化合物，而酸性流動(dòng)相則適合分離堿性化合物。

? 離子強(qiáng)度

流動(dòng)相的離子強(qiáng)度是指溶液中離子的濃度，它通過(guò)改變分析物與固定相之間的靜電相互作用來(lái)影響分離效率。流動(dòng)相的離子強(qiáng)度可通過(guò)改變?nèi)芤褐宣}或緩沖液的濃度來(lái)調(diào)節(jié)。

流動(dòng)相相當(dāng)于液相的血液，在使用過(guò)程中會(huì)有各種需要注意的事項(xiàng)。其中有些“坑”千萬(wàn)要注意！

1、加入有機(jī)溶劑之后測(cè)量移動(dòng)相酸堿度

如果用有機(jī)添加劑測(cè)量pH值，得到的pH值會(huì)與添加有機(jī)溶劑之前的值不同。然而最重要的一點(diǎn)是要保持一致。如果總是在加入有機(jī)溶劑之后測(cè)量pH值，那么務(wù)必保證在使用的方法中陳述步驟，這樣的話其他人就會(huì)按照統(tǒng)一方式進(jìn)行。這種方式并不保證百分百準(zhǔn)確，但至少可以保持方法的前后統(tǒng)一。這也許會(huì)比得到精準(zhǔn)的pH值更加重要。

2、沒有使用緩沖液

緩沖劑的作用就是用來(lái)控制PH值并阻止其發(fā)生變化。很多其他方法會(huì)改變流動(dòng)相的PH值，會(huì)引起停留時(shí)間、峰形以及峰值響應(yīng)的漂移。甲酸、TFA等不是緩沖劑。

3、沒有在正常酸堿度范圍內(nèi)使用緩沖液

每個(gè)緩沖鹽有兩個(gè)pH單位范圍寬度，在這個(gè)范圍內(nèi)可以提供穩(wěn)定性好的pH值。窗口之外的緩沖鹽不具備有效的抗pH值變化能力。要么在正確的范圍內(nèi)使用緩沖劑，要么選擇一種緩沖劑可涵蓋所需pH值。

4、向有機(jī)溶液中加緩沖液

將緩沖溶液與有機(jī)相混合，很有可能會(huì)引起緩沖液沉淀。在很多情況下，即使沉淀現(xiàn)象已經(jīng)發(fā)生了，但仍很難被發(fā)現(xiàn)。切記，一定要將有機(jī)溶液加入到水相當(dāng)中，這可以很好的降低緩沖液沉淀的幾率。

5、從0%用泵混合濃度梯度

現(xiàn)在使用的泵可有效的混合流動(dòng)相并實(shí)現(xiàn)在線脫氣，但并不是使用同一方法的任何人都會(huì)配有高質(zhì)量的泵。將A和B混合到一個(gè)單獨(dú)的溶液中，在100%線上運(yùn)行。如通過(guò)用50ml水混合制備有機(jī)950ml起始混合物。這樣做的好處就是可以減少HPLC之間的可變性，減少系統(tǒng)中產(chǎn)生氣泡和沉淀的可能性。值得注意的是泵混合液的比例是95:5并不代表瓶體的預(yù)混合保留時(shí)間也為95:5。

6、不要使用正確的改性酸(堿)改變緩沖液

只能使用形成你使用的緩沖鹽的酸或堿。如磷酸鈉緩沖液應(yīng)僅用磷酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)。

7、沒有在方法中闡述有關(guān)緩沖液的全部信息，如在1000ml的水中加入5g磷酸鈉

緩沖劑的類型決定了能夠緩沖的PH范圍。所需的濃度決定了緩沖強(qiáng)度。5克或無(wú)水磷酸鈉和5克一水合物磷酸一鈉具有不同的緩沖強(qiáng)度。

8、還沒先檢查就開始添加有機(jī)溶劑

如果上一個(gè)方法中基線B中使用過(guò)的是緩沖液，而你的方法中，基線B使用的是有機(jī)溶液，好在你可以沉淀泵管和泵頭中的緩沖劑。

9、支起瓶體清空最后一滴

很有可能沒有足夠的流動(dòng)相完成整個(gè)操作，最后樣品會(huì)冒煙的。除了可能存在燒干泵系統(tǒng)和柱子的可能性之外，流動(dòng)相也會(huì)蒸發(fā)的一干二凈，瓶體頂部的流動(dòng)相會(huì)發(fā)生變化。

10、利用超聲脫氣的流動(dòng)相

最重要的一點(diǎn)就是確保所有的緩沖鹽已經(jīng)溶解，但這是一種效果差的脫氣方式，并且它會(huì)很快讓流動(dòng)相升溫，從而引起有機(jī)成分蒸發(fā)掉。為了省去之后不必要的麻煩，請(qǐng)用五分鐘時(shí)間使用真空過(guò)濾你的流動(dòng)相。

11、選擇流動(dòng)相應(yīng)注意過(guò)濾溶劑

溶劑在使用前一定要用0.5pm的過(guò)濾器過(guò)濾，如果使用固體化學(xué)試劑(緩沖鹽)配制流動(dòng)相，過(guò)濾特別重要，不能讓固體微粒污染泵，阻塞進(jìn)樣器和柱頭過(guò)濾片。

12、注意保持儲(chǔ)液瓶的清潔

用普通溶劑瓶作流動(dòng)相儲(chǔ)液器應(yīng)不定期廢棄瓶子，最后一次應(yīng)用HPLC級(jí)的水或溶劑清洗，不能在清洗過(guò)程中留下污跡。

13、注意保證溶劑的質(zhì)量

一定要用HPLC級(jí)的溶劑，水也應(yīng)達(dá)到HPLC級(jí)，同樣也要使用高純度的緩沖鹽。

14、注意流動(dòng)相脫氣不充分

流動(dòng)相受熱或流動(dòng)相不同組分混合時(shí)會(huì)有氣體產(chǎn)生，氣泡進(jìn)入泵內(nèi)引起壓力波動(dòng)，增加噪音，色譜圖上出現(xiàn)毛刺。可試用下列方法解決問(wèn)題：

(1)流動(dòng)相再脫氣；

(2)采用更有效的因脫氣方法或兩種方法配合使用；

(3)改系統(tǒng)內(nèi)混合為系統(tǒng)外預(yù)混合。

HPLC所用流動(dòng)相必須預(yù)先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵的工作。

? 系統(tǒng)中氣泡的產(chǎn)生

流動(dòng)相本身存在，梯度淋洗混合后放出氣泡；

(1)氣泡的影響

存在于管路中，系統(tǒng)壓力不穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有偏差；存在于單向閥中，易造成液體回流，流量不準(zhǔn)確，甚至是不吸液存在于檢測(cè)器中，出現(xiàn)鬼峰，影響檢測(cè)準(zhǔn)確性。所以做液相對(duì)流動(dòng)相的氣泡和雜質(zhì)要求比較嚴(yán)格。氣泡會(huì)影響柱的分離效率，檢測(cè)器的靈敏度、基線穩(wěn)定性，甚至使無(wú)法檢測(cè)。噪聲增大、基線不穩(wěn)、突然跳動(dòng)。

此外，溶解在流動(dòng)相中的氧還可能與樣品、流動(dòng)相甚至固定相(如烷基胺)反應(yīng)。溶解氣體還會(huì)引起溶劑pH的變化，對(duì)分離或分析結(jié)果帶來(lái)誤差。溶解氧能與某些溶劑(如甲醇、四氫呋喃)形成有紫外吸收的絡(luò)合物，此絡(luò)合物會(huì)提高背景吸收(特別是在260nm以下)，并導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度的輕微降低，但更重要的是會(huì)在梯度淋洗時(shí)造成基線漂移或形成鬼峰(假峰)。

在熒光檢測(cè)中，溶解氧在一定條件下還會(huì)引起淬滅現(xiàn)象，特別是對(duì)芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響應(yīng)可降低達(dá)95%。在電化學(xué)檢測(cè)中(特別是還原電化學(xué)法)，氧的影響更大。除去流動(dòng)相中的溶解氧將大大提高UV因檢測(cè)器的性能，也將改善在一些熒光檢測(cè)應(yīng)用中的靈敏度。

(2)常用的脫氣方法

加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。對(duì)混合溶劑，若采用抽氣或煮沸法，則需要考慮低沸點(diǎn)溶劑揮發(fā)造成的組成變化。

a.氦氣脫氣

氦氣脫氣是很有效的脫氣方法。氦氣緩緩的通過(guò)流動(dòng)相趕去溶入的空氣，如果使用得當(dāng)，在10min內(nèi)可除去80%-90%的溶入氣體。由于氦氣在流動(dòng)相中的溶解度極低，所以用氦氣脫氣保護(hù)的流動(dòng)相可以認(rèn)為是一個(gè)無(wú)氣體溶解體系。其缺點(diǎn)是氦氣價(jià)格比較昂貴，會(huì)增加檢驗(yàn)成本。一般說(shuō)來(lái)有機(jī)溶劑中的氣體易脫除，而水溶液中的氣體較頑固。在溶液中吹氦是相當(dāng)有效的脫氣方法，這種連續(xù)脫氣法在電化學(xué)檢測(cè)時(shí)經(jīng)常使用。但氦氣昂貴，難于普及。

b.真空脫氣

也是比較常用的脫氣方法。現(xiàn)在多數(shù)企業(yè)都最常用這種辦法，貯液器被抽成部分真空，溶入的氣體蒸發(fā)形成氣泡溢出，其效果僅次于氦氣脫氣。在線脫氣只適合脫完氣之后的流動(dòng)相，在使用過(guò)程中的微量脫氣。

c.超聲波脫氣

將配制好的流動(dòng)相連容器放入超聲水槽中脫氣10-20min。這種方法比較簡(jiǎn)便，又基本上能滿足日常分析操作的要求，所以目前仍廣泛采用。這種方法只能除去30%的溶解氣體，有時(shí)還會(huì)引起氣體溶解度的增加。對(duì)氧敏感的檢測(cè)器不宜用此法。超聲脫氣比較好，10-20分的超聲處理對(duì)許多有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑/水混合液的脫氣是足夠了(一般500ml溶液需超聲20-30min方可)，關(guān)于超聲時(shí)間問(wèn)題眾說(shuō)紛紜，各實(shí)驗(yàn)室5-30分鐘不等，一般來(lái)說(shuō)流動(dòng)相組成為無(wú)機(jī)(緩沖鹽溶液)時(shí)，5-15分鐘即可，流動(dòng)相為是水和有機(jī)容積混合時(shí)，超聲時(shí)間要相對(duì)長(zhǎng)一些，時(shí)間的延長(zhǎng)不和效果成正比，且其中氣泡對(duì)色譜峰基線穩(wěn)定性與信噪比有一定影響，一般來(lái)說(shuō)影響不大，15min超聲即可足夠。此法不影響溶劑組成。超聲時(shí)應(yīng)注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內(nèi)液面不要高出水面太多。

d.加熱回流脫氣

該法雖效果很好，但適用范圍較窄。對(duì)于有機(jī)溶劑或混合流動(dòng)相不適合用此法，因?yàn)閾]發(fā)性組分會(huì)損失掉，改變流動(dòng)相的組成。綜合來(lái)說(shuō)，用真空抽濾后，再用超聲脫氣是常用的辦法，用氦氣的方法是效果好的辦法，而在線脫氣本身也是真空脫氣，但它可放到儀器上使用，是一種保證性的辦法。

首先離線(系統(tǒng)外)脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態(tài)，在停止脫氣后，氣體立即開始回到溶劑中。在1-4小時(shí)內(nèi)，溶劑又將被環(huán)境氣體所飽和。而在線(系統(tǒng)內(nèi))脫氣法無(wú)此缺點(diǎn)。常用的在線脫氣法為鼓泡，即在色譜操作前和進(jìn)行時(shí)，將惰性氣體噴入溶劑中。嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，此法不能將溶劑脫氣，它只是用一種低溶解度的惰性氣體(通常是氦)將空氣替換出來(lái)。此外還有在線脫氣機(jī)。

15、注意流動(dòng)相供給不暢

流動(dòng)相用完，管道中吸入氣體引起泵壓力不穩(wěn)。應(yīng)經(jīng)常觀察儲(chǔ)液器中流動(dòng)相的量，加足流動(dòng)相保證所有的樣品分析完畢。輸液管道上裝沉子沉至瓶底，儲(chǔ)液器蓋上留一小孔正好夾住進(jìn)液管，使其不能上下移動(dòng)。

過(guò)濾器阻塞引起管道和泵腔空化，壓力不穩(wěn)。過(guò)濾器被微粒所阻塞或長(zhǎng)霉，去掉過(guò)濾器后如果系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)正常，說(shuō)明已找出問(wèn)題，換上新的過(guò)濾器則可。有時(shí)候換上新的過(guò)濾器仍然不暢，那就需查流動(dòng)相的制備過(guò)程或換大孔徑的過(guò)濾器。不管如何流動(dòng)相都需要重新過(guò)濾。流速過(guò)高、阻力大，造成空化現(xiàn)象，這是由于過(guò)濾器孔徑、管道內(nèi)徑、流速和溶劑黏度等引起的。如果流速大于10mL/min，常會(huì)出現(xiàn)這種現(xiàn)象。使用以下方法解決：

? 使用低流速；

? 換大孔徑的過(guò)濾器；

? 增加進(jìn)液管道內(nèi)徑；

? 抬高或加壓儲(chǔ)液器；

? 不用過(guò)濾器，但流動(dòng)相一定要先過(guò)濾；

? 儲(chǔ)液器蓋子太緊，在儲(chǔ)液器內(nèi)形成真空，打出的流動(dòng)相不連續(xù)。應(yīng)松開蓋子或留有1mm的縫隙；

? 進(jìn)液管道阻塞或彎曲使泵抽不到液，注意調(diào)整進(jìn)液管道或更換新的。其它問(wèn)題包括滲漏或接頭松動(dòng)、泵部件損壞等，都能引起供液不正常。

16、注意防止流動(dòng)相和儲(chǔ)液器被污染

由于污染，噪音越來(lái)越大，檢測(cè)器基線上升。污染物可能被泵以穩(wěn)定的濃度打入系統(tǒng)，而再以穩(wěn)定的濃度流出來(lái)，所以在色譜圖中不出多余的峰。用梯度洗脫時(shí)弱流動(dòng)相可以使污染物聚在柱頂，流動(dòng)相強(qiáng)度增加后污染物可能被洗脫出來(lái)一個(gè)大的偽峰。有時(shí)基線噪音突然增大或突然提高，都是因?yàn)榉磸?fù)加進(jìn)新的流動(dòng)相或系統(tǒng)用得太久(通宵)所造成的。新加進(jìn)的流動(dòng)相有污染物或者流動(dòng)相長(zhǎng)霉，繁殖了細(xì)菌。臟的儲(chǔ)液器會(huì)污染清潔的流動(dòng)相。每種流動(dòng)相備有專用的儲(chǔ)液器，或者定期報(bào)廢儲(chǔ)液器。流動(dòng)相污染來(lái)自這幾個(gè)方面：

? 試劑質(zhì)量不高，玻璃器皿不合格；

? 微生物的影響；配制流動(dòng)相時(shí)操作不當(dāng)?shù)龋虼艘蟾呒兌然瘜W(xué)試劑和HPLC級(jí)溶劑。要注意玻璃器皿按規(guī)定清洗干凈；

? 為防止微生物生長(zhǎng)，每天要用甲醇清洗系統(tǒng)；

? 懷疑系統(tǒng)內(nèi)生長(zhǎng)了微生物，可用稀硝酸沖洗即可(注意不要損壞柱和管道系統(tǒng))；

? 真空脫氣時(shí)防止泵油帶入流動(dòng)相；

? 用清潔的惰性塞子、攪棒、過(guò)濾器和玻璃器皿配制流動(dòng)相；

? 已經(jīng)污染的流動(dòng)相一定要廢棄掉。

17、注意選擇流動(dòng)相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)

低交聯(lián)度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時(shí)遇到某些有機(jī)相會(huì)溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質(zhì)。堿性流動(dòng)相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。酸性流動(dòng)相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。

18、選擇流動(dòng)相應(yīng)注意純度

色譜柱的壽命與大量流動(dòng)相通過(guò)有關(guān)，特別是當(dāng)溶劑所含雜質(zhì)在柱上積累時(shí)。

19、選擇流動(dòng)相應(yīng)注意必須與檢測(cè)器匹配

使用UV檢測(cè)器時(shí)，所用流動(dòng)相在檢測(cè)波長(zhǎng)下應(yīng)沒有吸收，或吸收很小。當(dāng)使用示差折光檢測(cè)器時(shí)，應(yīng)選擇折光系數(shù)與樣品差別較大的溶劑作流動(dòng)相，以提高靈敏度。

20、選擇流動(dòng)相應(yīng)注意粘度要低(應(yīng)<2cp)

高粘度溶劑會(huì)影響溶質(zhì)的擴(kuò)散、傳質(zhì)，降低柱效，還會(huì)使柱壓降增加，使分離時(shí)間延長(zhǎng)，最好選擇沸點(diǎn)在100℃以下的流動(dòng)相。

21、選擇流動(dòng)相應(yīng)注意對(duì)樣品的溶解度要適宜

如果溶解度欠佳，樣品會(huì)在柱頭沉淀，不但影響了純化分離，且會(huì)使柱子惡化。

22、選擇流動(dòng)相應(yīng)注意樣品易于回收

應(yīng)選用揮發(fā)性溶劑。

23、選擇流動(dòng)相應(yīng)注意由強(qiáng)到弱

一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩沖溶液)進(jìn)行試驗(yàn)，這樣可以很快地得到分離結(jié)果，然后根據(jù)出峰情況調(diào)整有機(jī)溶劑(乙腈或甲醇)的比例。

24、選擇流動(dòng)相應(yīng)注意三倍規(guī)則

每減少10%的有機(jī)溶劑(甲醇或乙腈)的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規(guī)則。這是一個(gè)聰明而又省力的辦法。調(diào)整的過(guò)程中，注意觀察各個(gè)峰的分離情況。

25、選擇流動(dòng)相應(yīng)注意粗調(diào)轉(zhuǎn)微調(diào)

當(dāng)分離達(dá)到一定程度，應(yīng)將有機(jī)溶劑10%的改變量調(diào)整為5%，并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調(diào)整率，直至各組分的分離情況不再改變。

26、流動(dòng)相的配制注意有機(jī)溶劑和水性溶劑的混合方法

有機(jī)溶劑和水性溶劑的混合液作為流動(dòng)相是經(jīng)常的，但由于混合方法不同，有時(shí)分析結(jié)果相差很大。如20mM磷酸鈉緩沖液(pH2.5)90%與乙腈10%的混合液，混合比為9：1時(shí)，20mM磷酸鈉緩沖液(pH2.5)90%與乙腈10%的體積比為9：1，也就是可以解釋為各自按體積比例的相當(dāng)量稱取后進(jìn)行混合。另外，按10%乙腈解釋，用20mM磷酸鈉緩沖液(pH2.5)，將乙腈稀釋調(diào)制也可以成立。在后者情況下，產(chǎn)生混合體積減少部分，余下的添加20mM磷酸鈉緩沖液。兩者雖然沒有太大的差別，但由于混合方式不同，分析結(jié)果特別是保留時(shí)間也會(huì)有大差別，這點(diǎn)必須注意。

27、50%或(V/V=1/1)乙腈水溶液的配制方法

對(duì)于用V/V=1/1的表示配制乙腈水溶液，多按這種方法進(jìn)行：用量筒測(cè)定乙腈500mL，用另一量筒測(cè)定水500mL，兩種液體在瓶?jī)?nèi)充分搖晃混合。不過(guò)50%乙腈水溶液的表示時(shí)，同樣也多是按上述方法配制，但查化學(xué)辭典時(shí)，實(shí)際上是按這種方法進(jìn)行配制：首先將500mL乙腈，注入1L的量瓶中，量瓶邊攪拌邊加水，等待液溫達(dá)到室溫，用全量水，使溶液到1L。這樣一來(lái)，用%表示和“V/V"體積比表示，最終得出的流動(dòng)相組成不同。也就是說(shuō)，混合溶劑的密度，與由原溶劑密度計(jì)算的單純平均值不相同，所以用上述兩種方法調(diào)制的流動(dòng)相組成差異。如在室溫(25℃)附近水50mL和乙腈50mL混合時(shí)體積不是100mL，而有所減少，約為96mL。在一般情況下，多用操作簡(jiǎn)便的第一種方法。

28、流動(dòng)相的配制注意溶劑體積的溫度影響

溶液的密度受周圍溫度的影響。剛從溶劑冷藏箱拿出來(lái)的溶液溫度與實(shí)驗(yàn)室的室溫相比，要低不少，乙腈和水混合液因發(fā)熱反應(yīng)，溶液溫度升高。因此為能調(diào)制再現(xiàn)性好的流動(dòng)相，建議在使用前用恒溫水浴鍋將液溫調(diào)到接近室溫。

29、流動(dòng)相的配制注意用兩臺(tái)泵進(jìn)行溶劑混合

雙泵主要是在探討流動(dòng)相的配比或者梯度洗脫是比較方便，知道確切的液相色譜儀條件時(shí)，建議配好后使用的話，混合比較均勻效果較好。在反相分析中，常用的有機(jī)溶劑和水的等濃度法，使用高壓兩元梯度系統(tǒng)，用兩臺(tái)泵將流動(dòng)相分別輸液后混合等封閉式混合時(shí)與預(yù)先在瓶?jī)?nèi)混合后用1臺(tái)泵輸液時(shí)，因混合后體積變化的不同，保留時(shí)間也有所不同，一定要注意。不僅是流動(dòng)性的調(diào)制方法，試樣溶液和其他溶液的調(diào)制也經(jīng)常有上述問(wèn)題。在這種情況下，就要求各部門在制作相關(guān)溶液配制方法時(shí)能規(guī)定通則，定義設(shè)計(jì)溶液的調(diào)制方法，這樣避免混亂，以在日常工作中更好地記住這些表示方法。

30、注意流動(dòng)相的pH

如需在一定PH值下操作，須定期測(cè)定流動(dòng)相的PH值，大氣中的CO2溶解在流動(dòng)相內(nèi)將引起PH值的改變，特別是貯液瓶密閉不嚴(yán)時(shí)這種影響可能更大。

31、注意更換柱子及流動(dòng)相

軟質(zhì)或半軟質(zhì)填料的溶脹率隨溶劑極性的變化而變化，使用新柱時(shí)應(yīng)先用25-30倍柱容積的合適流動(dòng)相平衡。更換流動(dòng)相時(shí)，如果兩種流動(dòng)相不互溶，需采用過(guò)渡溶劑使前一種流動(dòng)相逐步溶解除去。如2、2、4-三甲基戊烷換成甲醇時(shí)，必須用乙酸已酯或其他溶劑過(guò)渡，直到標(biāo)準(zhǔn)物保留值達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。