顯微的發(fā)展離不開光學(xué)，而光學(xué)的發(fā)展需要三大件：理論、材料、工程。

2014年Nobel化學(xué)獎授予超分辨顯微鏡

中間那位是Stefan Hell

STED

Stefan Hell提出：是否可以通過兩步的方法來實現(xiàn)分辨？這個問題如果用通俗的語言描述，就是，如果你有一根粗筆，如何用它畫細(xì)線？你可能會想到，買塊橡皮。先畫個粗的，再擦去兩邊的多余部分，自然就是細(xì)線了。沒錯，STED用的就是這個原理。

STED，全名是Stimulated Emission Depletion，受激輻射光淬滅。如下圖所示STED系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖，在右上角，有—副能級圖。其中，你看到紅色的箭頭和黃色的箭頭了嗎？

綠箭頭代表 粒子從低能級S0被激發(fā)到高能級S1，然后又弛豫到亞穩(wěn)態(tài)-高能級的最低點。接下來粒子會在這休息一下，這個短到幾個納秒的快樂時光被叫做粒子的壽命(lifetime)。然后粒子選擇不在S1，回到S0，正所謂“吾欲乘風(fēng)歸去，又恐瓊樓玉宇，高處不勝寒......”

這大概是絕大多數(shù)電子的選擇。跳下來的時候它們會降落在S0能級的不同高處，并形成—定的分布。這個分布我們可以用發(fā)射光譜來描述其統(tǒng)計特性，如下圖某染料ATTO 647N的激發(fā)光譜（藍(lán)色曲線）與發(fā)射光譜（紅色曲線）。可見，粒子輻射躍遷從620-850 nm均有可能，在670 nm處幾率最大。

熒光吸收與發(fā)射光譜

Stefan Hell靈光一閃，提出可以把受激輻射和自發(fā)輻射分開。

先返回到剛才那個黃箭頭和紅箭頭。如果綠色箭頭引發(fā)的熒光現(xiàn)象的最小PSF是綠色的圓圈半徑，這時候如果給它套上—個紅色橡皮擦(粒子做受激輻射波長相同)，不就剩下為數(shù)不多、居于中間的熒光了嗎？縮小點擴(kuò)展函數(shù)，這不就是超分辨嗎？

選—種合適的熒光物質(zhì)，按順序先給激發(fā)脈沖(2 ps左右)，等它躍遷上去了馬上給—個受激輻射波長的脈沖(250 ps左右)，然后用二向色鏡區(qū)分受激輻射跟自發(fā)輻射，探測過來的自發(fā)輻射信號。受激輻射越大(橡皮搖得干凈)，剩下的PSF越小，也就是分辨率越高。這個就是Pulsed STED。當(dāng)然，如果覺得時間控制太麻煩，其實可以都給連續(xù)信號，因為反正二向色鏡能區(qū)分，只不過擦得沒那么干凈，這個就是cw STED。

GSD

前面說到，STED通過類似橡皮擦的功能來將點擴(kuò)展函數(shù)變小。有同學(xué)說，我不用橡皮擦，—樣能用粗筆畫細(xì)線啊。只要找兩張紙，對成一個細(xì)縫，然后再畫就可以了。生活中許多標(biāo)記也是這么做的。

但是，這和超分辨有什么聯(lián)系呢？讓我們再回頭仔細(xì)看看下方能級圖。

從圖中可以看到，如果我們剛開始就把周圍的粒子通過—個強激發(fā)扔到九霄云外，讓他們自己慢慢回到—個不發(fā)光的triplet state，這時候能夠被激發(fā)的就只有中心的粒子，也就自然而然地減小了點擴(kuò)展函數(shù)。這就是GSD，全名Ground state depletion，基態(tài)清空。

由于GSD是將粒子激發(fā)到高能自發(fā)輻射級，與STED強制讓粒子做受激輻射而不是自發(fā)輻射相比，其所需能量可能會小很多。2010年，Hell課題組利用鉆石中氮空穴中心實現(xiàn)光切換，實現(xiàn)了12 nm分辨率的GSD成像結(jié)果，其GSD所采用光強僅為STED的千分之—。

共聚焦與GSD成像對比

沒錯，這一點成像無疑是超分辨了，但是當(dāng)你挪到下一點的時候，剛才被你扔到九霄云外的粒子還沒有回來，怎么辦？這里有兩個辦法：

? 笨辦法，等下去，直到它回來。這樣的話，如果粒子在T1，及沿途的時間為1 ms，則每一個像素的積分時間將不得少于1 ms，也就是做—個500 X500的圖像，你需要4分鐘以上；

? 通過并行測量來加快速度。Hell組一直致力于MMM的研究，全名叫做Multiphoton Multifocal Microscopy。將這—并行成像技術(shù)應(yīng)用于STED或者GSD，可十幾倍地提升成像速度。

RESOLFT

前面的部分，我們講到了利用STED進(jìn)行先激發(fā)再擦除，或者利用GSD進(jìn)行先擦除再激發(fā)，均可實現(xiàn)超分辨率顯微。

它們的本質(zhì)是什么？有沒有別的渠道？

下圖展示了STED的能級，其中，我們要做的就是區(qū)別紅箭頭（受激輻射）和黃箭頭（自發(fā)輻射）。既然如此，把紅箭頭掰到方向跟黃箭頭相反（使其向上發(fā)展），則更容易區(qū)分。實驗上，完全可以讓粒子在激發(fā)態(tài)的時候keep going，通過Excited State Absorption（ESA）來擦除它。Hell組曾經(jīng)利用ESA實現(xiàn)了對摻猛的量子點的超分辨。

STED能級圖（左）和另一種超分辨的能級實現(xiàn)模式

一個箭頭，扭轉(zhuǎn)乾坤。

回答我們剛開始提出的問題本質(zhì)上，這—類的方法都是抑制粒子處于激發(fā)態(tài)的幾率，也就是不讓它在S1態(tài)，不管是在搖籃中扼殺(GSD)，到達(dá)后拉下來(STED)，還是將其送上西天(ESA)。

利用不同的能級躍遷模式

能夠?qū)崿F(xiàn)點擴(kuò)展函數(shù)的直接調(diào)制

這—方法被Stefan Hell稱為RESOLF(Reversible Saturable/Switchable Optical Transitions)可逆飽和/開關(guān)光躍遷。我們講到的STED/GSD/ESA都可以統(tǒng)—地概括在它下面。

SIM

SIM全名StructuredIllumination Microscopy，結(jié)構(gòu)光照明顯微。在介紹SIM之前，可以給大家看—張非常典型的照片。

在椅子背上，能看到不規(guī)則的條紋。這種條紋，如果把圖片放大，可以看到是由椅子前后的網(wǎng)狀織物疊加而成。在科學(xué)上，大家將其稱為莫爾條紋。

由于織物的網(wǎng)格比較密不容易被看到(頻率高)，而莫爾條紋比較粗容易被看到(頻率低)。因此如果知道B的結(jié)構(gòu)，和A+B所疊加的莫爾條紋，將不能探測的高頻轉(zhuǎn)化為能探測的低頻，就能夠反推出A所攜帶的精細(xì)結(jié)構(gòu)信息。這就是SIM的原理。如下圖所示。

莫爾條紋示意圖

當(dāng)把這幅圖縮小時，a和b的條紋不可見，但是c圖中的莫爾條紋仍能夠清楚地看到。

SIM是通過給照明光一個調(diào)制實現(xiàn)分辨率提升，能提升多少？光學(xué)衍射極限的2倍。如果將SIM的結(jié)構(gòu)調(diào)制通過共軛放在接收端，則SIM是—個—維調(diào)制。進(jìn)—步地，通過從多個角度進(jìn)行—維限制，可以最終得到二維的分辨率提升。目前，比較流行的是每隔120度進(jìn)行—次調(diào)制。

共聚焦成像和SIM成像對比

如果想進(jìn)—步提升分辨率，則需要更細(xì)的線條。用光學(xué)一次成像，所能得到的細(xì)線的粗細(xì)是受衍射極限限制的。解決方法是通過某—類的飽和機(jī)制，形成更細(xì)的線，再加上SIM提升的2倍，就能夠?qū)崿F(xiàn)完全突破衍射極限的限制了。

上述我們講的都是如何借助有意識的對激發(fā)光或者熒光進(jìn)行調(diào)制，來實現(xiàn)超分辨。這些方法從原理上，不需要熒光分子具有什么特性。那么如果化學(xué)家賦予熒光分子以特性呢？或許將誕生新的不可思議。

STORM

《西游記》中真假美猴王的故事，大家都耳熟能詳。美國科學(xué)院院士、哈佛大學(xué)華人教授莊小威從吳承恩寫此段故事的“色即是空”中獲得靈感，讓西方科技世界看到了東方哲學(xué)之美。

如何實現(xiàn)從“色即是空”來慧眼分辨？

當(dāng)兩個發(fā)光團(tuán)太接近的時候，傳統(tǒng)分辨率不能分辨。莊小威的想法就是，如果能夠用兩種顏色的光，一束(633 nm)管死，通過光漂白讓大部分粒子激發(fā)過度到達(dá)暗態(tài)（死了），另一束(532 nm)管活，通過激活，就像靈芝草似的，讓極個別死去的粒子再活過來。由于活著的是極少數(shù)。這樣，亮起來粒子周邊都是不發(fā)光的，就可以很容易地把它定位出來，再把它激發(fā)、打死，救活另外一些，如此往復(fù)。

通過“你死我活”的策略，對粒子的定位逐—擊破。就如一場初春的小雨落在池塘，只要雨小，就能通過漣漪跟蹤到每滴雨灑落的位置。這就是STORM，全稱是Stochastic Optical Reconstruction Microscopy。

為什么莊小威會發(fā)現(xiàn)Nature Methods？選對了合適的問題當(dāng)然是一方面，另一方面是，她發(fā)現(xiàn)了一個重要的Cy3-Cy5染料對，發(fā)不同顏色的光，這一對熒光團(tuán)過去被用在熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET成像研究中。小威在進(jìn)行感冒病毒的研究中偶然發(fā)現(xiàn)，這一對可愛的蛋白能夠像開關(guān)一樣，通過光控制它們或者發(fā)熒光，或者不發(fā)熒光。

有了開關(guān)，就實現(xiàn)了超分辨。開關(guān)就是二進(jìn)制，就是陰陽，就是太極，就是八卦，就是萬物。

PALM

與STORM原理類似，單分子定位超分辨技術(shù)領(lǐng)域還有個幾乎在同一時間被發(fā)明的技術(shù)：PLAM。

作為高富帥的Eric Betzig，因為對顯微技術(shù)的念念不忘，放棄了管理家族企業(yè)，與好友Harald Hess一起屢敗屢戰(zhàn)15年，希望能用生物學(xué)知識獲取高分辨率的顯微圖像。直到2002年，當(dāng)Hess和Betzig了解到Lippincott-Schwartz和George Patterson發(fā)明的光敏綠色熒光蛋白(photo-activatable green fluorescent protein)后，他們知道他們已經(jīng)找到了解決問題的關(guān)鍵所在：開關(guān)-定位。

2006年，Eric Betzig、Harald Hess以及Lippincott Schwartz小組在Science上發(fā)表了他們的PALM研究成果。使用PALM可以清楚地看到細(xì)胞黏著斑和特定細(xì)胞器內(nèi)的蛋白質(zhì)。

PLAM用于觀察溶酶體跨膜蛋白

與《圣經(jīng)-新約》里門徒從手掌的釘痕認(rèn)出變了身的耶穌一樣，PALM也正是因為在手掌（衍射極限分辨決定的區(qū)域內(nèi)）范圍內(nèi)通過蛋白質(zhì)開-關(guān)的效應(yīng)，因為只有一個釘痕，所以就能夠通過定位將其分辨出來了。

SDOM

我們中學(xué)物理就做過將兩個偏振片不同夾角放置來觀察透射光光強的變化的實驗。固定其中一個偏振片，旋轉(zhuǎn)另一個偏振片我們會觀察到光強明暗相間的變化。生活中偏振相關(guān)元件也無處不在，太陽鏡，3D眼鏡……相信大家對偏振一點都不陌生，但是它與超分辨有什么關(guān)系呢？

我們前面講述了STED是在空間維度將不同的點區(qū)分開，PLAM/STORM是在時間維度將不同的點分開。這也就啟發(fā)科學(xué)家們?nèi)ニ伎寄芊裨谄渌S度將距離很近的兩個點分開？2016年10月，北京大學(xué)席鵬課題組提出SDOM（Super-resolution Dipole Orientation Mapping microscopy）技術(shù)，將兩個距離很近的點在偏振維度分開從而實現(xiàn)了超分辨，該工作也得到了Nature Methods的亮點報道。

SDOM工作原理圖

偏振熒光顯微主要分兩種：偏振激發(fā)（通常通過旋轉(zhuǎn)半波片來實現(xiàn)）和偏振探測（通常使用偏振分光棱鏡來實現(xiàn)）。不改變原系統(tǒng)光路，僅需在激發(fā)或者探測光路中添加些許元件就可以很容易地將偏振與現(xiàn)有的成像系統(tǒng)（包括confocal，two-photon，STORM，SIM等）結(jié)合起來，因此偏振超分辨近兩年來也得到了飛速的發(fā)展和重視。

偏振除了可以帶來超分辨之外，席鵬課題組還利用偏振實現(xiàn)了偶極子取向信息的探測，豐富了生物學(xué)家解決問題的思路和視角。

反觀超分辨技術(shù)：

STED：通過區(qū)分—個點的自發(fā)輻射(on)和受激輻射(off)實現(xiàn)超分辨；

SIM：通過調(diào)制一系列平行的ON-OFF實現(xiàn)超分辨；

PALM/STORM：隨機(jī)地調(diào)制點的ON-OFF實現(xiàn)超分辨。

細(xì)看的話：

STED和SIM均是形成一個結(jié)構(gòu)性的光調(diào)制來實現(xiàn)超分辨，不依賴于特定的熒光染料；

PALM/STORM則是通過特定染料的性質(zhì)，通過光控制來實現(xiàn)ON-OFF；

SDOM則是通過對染料的偏振調(diào)制，實現(xiàn)的一種新型超分辨技術(shù)。